欧盟生物仿制药开发：可比性研究决定成败

自2006年山德士的Omnitrope（重组人生长激素，辉瑞健豪宁的仿制药）获得欧盟批准，生物仿制药开始在欧洲上市。随后，有数家公司也上市了几种其他生物制剂（如促红细胞生成素和非格司亭）的仿制版本。虽然目前在美国尚未有生物仿制药获得批准，但美国对生物仿制药审批的法律框架已经制定，生物仿制药的批准上市仅仅是一个时间问题。

由于生物仿制药在美国还没有获得批准，美国的指导原则在实践中的应用还有待检验，而欧盟在2004年就为生物仿制药颁布了一项修正案。欧洲在过去几年里的经验，可为我们开发生物仿制药提供依据和参考。

安全替代性是基础

为了确认生物仿制药与其原研参比制剂具有生物相似性，较广泛的理化性质和功能研究是必需的。

通常情况下我们对原研产品的制造过程知之甚少，生物产品确切性质的变异性是不可避免的，因此，其与参比制剂内部相似性情况必须予以证明。另外，与产品本身或制造过程中的任何杂质都必须进行确认、定性、量化，并与参比制剂比较。生物仿制药与参比制剂之间类型、性质和程度的差异，在递交申请批准时必须描述清楚。

产品评估时，如果这两种产品确实非常相似，还应考虑多种不同因素。首先，表达系统必须考虑的因素包括：被转染的细胞系的确认，转基因的序列的检测，启动子控制区的研究，整体遗传一致性和克隆基因的稳定性。细胞基质生物安全性测试包括主细胞库（MCB）和细胞，而用于生产的体外菌龄也必须进行限制，以保证MCB遗传稳定性。无论是信使核糖核酸（mRNA）或互补脱氧核糖核酸（cDNA），基因的拷贝数和基因测序过程都应在细胞基质中进行确定。同时还应该进行荧光原位杂交（FISH）分析和限制性内切酶分析。

其次，在制造过程中必须进行的研究包括所用的细胞系产生的糖基化结构和异质性，以及这两种产品的表达水平和内源性逆转录病毒颗粒的表达。此外，必须评估细胞的可行性和生产率，产品的完整性，宿主细胞蛋白质和DNA的降解产物和水平。介质的性质也很重要，如是否含有血清，是无蛋白还是化学的。生产过程中需要考虑的问题包括生物反应器形式和下游处理过程，以及相关杂质的去除，病毒灭活和去除，产品配方，产品的稳定性等。当然，与所有的医药产品一样，生物仿制药的病毒和微生物安全性必须考虑到。

可比性研究最关键

生物仿制药制造过程中的微小变化便可以导致产品的有效性和安全性发生改变。根据欧洲药品管理局（EMA）相关指导原则，要求广泛的可比性测试证明生物仿制药与原研参比制剂相比具有相似的质量、安全性和有效性。

生物仿制药与原研参比制剂的各种分析检测，主要是对生产批次之间的物理、化学和生物特性的比较。分析方法对生物仿制药产品的上市授权，在监管部门的决策过程中起着重要作用。如果没有进行桥接试验研究，毒理学和早期临床试验中所用的样品也必须是等效的。而证明两个独立的制造批次是相同的，关键是基于测试和性质参数要达到一定的一致性水平。可以说，可比性研究成功与否决定着生物仿制药开发的成败。

化学分析与小分子仿制药开发一样，生物仿制药的结构必须被分析，但二者的区别是，生物仿制药并非是证明其与参比制剂完全一样，而是足够接近，且没有明显的或可见的生物活性功能差异。生物仿制药分析表征应包括一级、二级、三级和四级结构评估，生物活性和产品杂质的分析。所有这些要素都必须在生物仿制药与参比制剂可比较性研究中确认，且进行更深入的特征描述。对于分子量的评估，应使用一项或多项质谱，通常是基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)、电喷雾质谱(ESI-MS)或液相色谱-质谱联用（LC-MS）。其他技术如十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、高性能液相色谱（HPLC）、肽图谱分析等也被用来进行异构体和杂质研究。

目前，还没有任何单一分析技术能够达到生物仿制药所需的所有标准和特征的可比性研究目的，因此，需要依靠各种各样的分析工具完成。如质谱可以用来分析生物仿制药和原研产品之间的分子差异，毛细管等电聚焦（CIEF）可以用来提供样品制造过程中的数据，Biacore分析（生物大分子相互作用分析仪）用来评估受体结合功能，肽图谱分析用来区分不同的酶或酶组合物。

生物分析：生物学相关测试可用于检测产品的活性，也可以用于蛋白高次结构有关信息的收集。与原研参比制剂的类比分析是生物分析的最终目的。生物仿制药和参比制剂的质量属性完全一致是不太可能的，两种活性物质之间的微小结构性差异是可以接受的，但必须对翻译后修饰及杂质分布的差异进行明确研究，如果产品的安全性和有效性相关质量属性可比性研究能够获得认可，那么这些差异将被视为可接受。

细胞效能分析：效能是一个关键的质量属性。效能分析是对生物活性的测定，因此需要大量的释放测试和稳定性测试。生物效能分析可以应用体外细胞系统、体内试验或酶进行测定。有几种不同的基于细胞的分析是可用的，包括配体结合试验，细胞增殖、细胞毒性和细胞死亡研究等。可能同时需要一个以上的生物分析方法，这主要根据生物制品的作用机制或复杂性而定。

细胞分析：可减少动物的使用，既快捷又可控制成本。细胞分析还提供了与原研参比制剂生物学功能等价的证据。

效能分析通常通过一定范围内的浓度检测产品的生物活性，比较生物仿制药与参比制剂。由此产生的剂量-反应曲线，可描绘出生物反应是兴奋或抑制。这种效能通常通过一个半数有效浓度EC50值（半数最大效应浓度）或IC50值（半数最大抑制浓度）表示。

生物分析系统的固有变异性和这些分析的分辨率（例如稀释系列的函数），可能会导致不同分析检测效能的差异。因此，在生物仿制药效能测试中，相对于参考标准的分析要考虑到这一点。

除了显示生物仿制药与参比制剂是否具有相似的生物学效应，效能分析还必须足够灵敏，以区分生物活性和稳定性较小的差异，在一个治疗浓度范围内可以定量读数。

非临床动物实验研究：应比较体外药理学和体内研究，包括药效试验、药代动力学评估和毒理学研究（包括毒代动力学耐药抗体和耐受性评估），旨在最大限度的获得参比制剂和生物仿制药产品之间的比较信息。必须进行临床应用相关的药效学和活性评估，至少有一次重复剂量毒性试验。该研究的毒代动力学分析将包括抗体滴度，交叉反应和中和能力。常规的安全药理学、生殖毒性、致突变性和致癌性研究，生物仿制药并不需要。生物仿制药与原研参比制剂相比，药理活性、药代动力学行为或毒理耐受性的不明显的差异，在提交给监管机构时亦应作为参考资料。

临床研究：在欧洲，虽然生物仿制药并不需要进行所有的人体安全性和有效性研究，但一定程度的临床研究也是必不可少的。通常在健康志愿者中进行的Ⅰ期安全性研究必须执行；还有Ⅲ期生物仿制药与参比制剂相对效果比较研究，其中应包括药代动力学、药效学和临床疗效评估。

即使获得批准，生物仿制药也必须执行临床安全性和药物警戒程序。可能出现的问题之一是免疫原性。目前有多种方法可以用来执行免疫原性试验。双抗原桥接检测一直是优选的方法，因为该方法通过优化可以应用在任何宿主物种上进行免疫原性试验。其他方法还包括应用酶联免疫吸附试验（ELISA）技术，电化学发光技术（Meso Scale Discovery），免疫组织化学，电化学，表面等离子体子共振。

EMA人用医药产品委员会已颁布了多项生物仿制药指导原则，对该类产品上市提出了详细要求。EMA指导原则涵盖了一系列的问题，包括制造、检测和可比性研究，化学和生物分析以及临床试验要求。除了药学、化学和生物数据，生物仿制药的上市还要提供额外的毒理学和其他非临床和临床数据。归根结底，关键是要证明生物仿制药产品与参比制剂在质量、安全性和有效性方面具有相似性。

延伸阅读

生物仿制药是与原研参比制剂等效的生物衍生治疗药物。所谓的“等效”包括功能和结构。由于生物制剂对生产变化要求具有的敏感性，此类产品特别难复制。与小分子药物不同，生产过程中或者产品的任何变化，都可能会导致生物仿制药与参比制剂之间存在着巨大的差异。

欧盟（EU）在2004年为生物仿制药颁布了一项修正案。但在欧洲，术语“生物相似”还未明确定义，一个产品是否是可被作为“类似的生物医药产品”接受使用主要依赖于分析程序，使用的制造工艺，临床和管理经验。欧洲药品管理局（EMA）要求对两种产品（生物仿制药和参比制剂）的类似性质进行可比性研究，用来证实生物仿制药的质量、安全性和有效性。有时，尽管生物仿制药和参比制剂之间的糖基化模式和杂质分布存在着差异，也会获得EMA批准。

美国食品药品管理局（FDA）在2010年3月建立了生物仿制药框架，与欧洲颁布的指导原则有显著的差别。FDA颁布的指导原则指出，生物仿制药的临床活性成分必须与参比制剂具有高度相似性，在安全性、纯度和疗效方面不能有临床意义的差异。生物仿制药和参比制剂必须具有相同的作用机制，相同的剂型和剂量，以及相同的给药方式。